I.C.Q.E.M. 

 

PROGETTO STRATEGICO DEL C.N.R.

 MODELLISTICA COMPUTAZIONALE DI SISTEMI MOLECOLARI COMPLESSI

RELAZIONE SULL'ATTIVITÀ SVOLTA NEL 1998 NELL'AMBITO DEL PROGETTO:

Meccanismi molecolari del riconoscimento
in sistemi chimici e biochimici complessi

U.O. PRESSO L'ISTITUTO DI CHIMICA QUANTISTICA ED ENERGETICA MOLECOLARE DEL C.N.R. - PISA
(Responsabile Scientifico: C. Ghio)

Lo studio teorico del riconoscimento molecolare inteso come interazione a livello molecolare tra un sistema di dimensioni limitate ed uno molto più esteso (quali ad esempio le coppie ligando (o farmaco)/recettore, substrato (o inibitore)/enzima, molecola/surperficie, ecc.) rappresenta una sfida reale, non solo per ciò che riguarda le dimensioni dei sistemi trattati. Nel caso particolare di interazioni tra substrato ed enzima la struttura "legata", di cui in genere non sono disponibili le coordinate cristallografiche, può essere costruita facendo delle ipotesi di interazione tra il substrato ed i residui del sito attivo, derivate dalle informazioni sperimentali disponibili. Tali ipotesi, il cui successo consente di stimare il grado di comprensione raggiunto dei fenomeni coinvolti, nel caso in cui non fossero adeguate potrebbero tuttavia condizionare pesantemente lo studio.
Inoltre proprietà e caratteristiche dei composti possono variare notevolmente in seguito alla sostituzione di atomi di idrogeno con atomi o gruppi polari che alterano il campo interno della molecola. Uno studio di questo tipo è stato da noi affrontato preliminarmente su uno dei costituenti tipici (l'indolo) di alcune sostanze che si sono dimostrate potenziali antagoniste delle tachichinine [1], per valutare quale sostituente è in grado di migliorare le capacità di interazione ipotizzate.
Nel recettore si trovano dei residui di istidina che da dati di mutagenesi sito-specifica sono importanti per legare tali sostanze. Pertanto durante il primo anno di attività si sono cercati in letteratura arrangiamenti delle catene laterali aromatiche di triptofano e istidina, trovando una notevole varietà di orientazioni reciproche: stacked (accatastate in modo parallelo o antiparallelo, sia con spostamento laterale sia senza) con prevalenza di interazioni di tipo pi greco, o T-shaped (a forma di T) con interazioni simili a quelle di legame a H. Inoltre sono state valutate la forza e la natura di tali interazioni preferenziali tra le catene laterali aromatiche dei residui amminoacidici e molecole peptidiche o non peptidiche analoghe dell'antagonista, ricorrendo a sistemi modello [2].
Tuttavia è necessario tener conto della flessibilità conformazionale di entrambi i sistemi. Per questo si è passati dallo studio ab initio, con l'inclusioni di effetti correlativi, delle interazioni tra complessi di tipo pi greco [2], affrontato nel corso del primo anno di attività di questo Progetto Strategico, all'esame sistematico di tutte le possibili orientazioni e distanze, effettuato con un metodo classico, estremamente meno costoso, che è stato necessario validare a tale scopo [3]. Nel corso del secondo anno di attività abbiamo quindi confrontato i risultati ottenuti con il metodo classico, per le stesse interazioni preferenziali dell'indolo con il 5-metilimidazolo, con quelli ab initio ricavati in precedenza. In un primo tempo abbiamo considerato il 5-metilimidazolo protonato in posizione delta come modello dell'istidina delta in quanto, utilizzando il force field di SYBYL per ottimizzare la posizione dei protoni aggiunti alle strutture cristallografiche, è stata ottenuta generalmente tale forma. Mentre nello studio effettuato nel corso del primo anno di attività [2] abbiamo preso in considerazione con metodi ab initio a livello MP2, includendo anche correzioni counterpoise, le orientazioni sperimentali variando solamente la distanza di equilibrio, nel periodo successivo, dopo aver verificato che la meccanica molecolare riproducesse in modo affidabile i risultati dei calcoli ab initio più raffinati, abbiamo esteso l'analisi a tutti i possibili addotti paralleli ed ad alcuni di quelli perpendicolari [3].
Gli addotti paralleli vanno da quelli con i centroidi X1 e X2 (vedi Schema) lungo lo stesso asse perpendicolare ai piani degli anelli a quelli con gli assi dei centroidi distanti tra loro di 1-2-3 Å in tutto lo spazio sovrastante l'anello dell'indolo, considerando tutte le possibili orientazioni di uno degli anelli rispetto all'altro. Anche per gli addotti perpendicolari, limitatamente a quelli con il 5-metil imidazolo nel piano perpendicolare a quello dell'anello indolico (indole across), sono state considerate tutte le possibili posizioni con gli assi dei centroidi allineati o spostati di 1-2-3 Å, scartando solo le strutture con il gruppo metilico diretto verso l'indolo, in quanto tale gruppo sostituisce il C beta dell'istidina.
Nel corso del secondo anno di attività è stato inoltre iniziato uno studio su di un sistema ancora più complesso, in quanto riguarda le interazioni tra un segmento di DNA ed un antitumorale della classe delle antracicline, il MEN10755, disaccaride analogo della doxorubicina. I primi risultati ottenuti sono stati presentati a due congressi (poster 3 e 4).

 Lavoro 3. Parecchi complessi istidina-triptofano, derivati dalle strutture cristalline disponibili nel Brookhaven Protein Data Bank, sono state esaminate con la meccanica molecolare (MM) usando il force field della Tripos e cariche determinate con il metodo di Gasteiger-Hückel. Alcuni degli addotti considerati (stacked o T-shaped) sono mostrati nella figura con gli anelli indolici sovrapposti. I risultati di MM sono stati paragonati con quelli ab initio a livello MP2 (sia corretti counterpoise -CP- per il basis set superposition error -BSSE- sia non corretti), precedentemente ottenuti usando set di base estesi su 5-metilimidazolo e indolo (vedi Schema 1) come sistemi modello [2].
La MM sottostima considerevolmente l'energia di interazione tra i due monomeri in confronto ai risultati ab initio MP2 non corretti CP, mentre l'accordo è molto migliore dopo l'inclusione della correzione al BSSE a livello MP2 in tutti i casi esaminati.
L'affidabilità della teoria del funzionale densità (DFT) nello studio di questi sistemi è stata verificata per 1esaB, usando il funzionale B3LYP/6-31G* sulle geometrie interne dei partners ottimizzate a livello HF/6-31G*. Tuttavia il DFT produce una energia di interazione, che risulta essere solo leggermente più favorevole che a livello HF, probabilmente per la mancanza della correlazione nelle interazioni intermolecolari, che invece sembra di importanza fondamentale per descrivere questo tipo di interazioni.
Quindi la MM è un metodo decisamente buono per analizzare qualitativamente la dipendenza dell'energia di stacking dalla rotazione degli anelli e dallo spostamento tra i loro centroidi. L'energia di interazione è stata ottimizzata in funzione della distanza tra gli assi dei centroidi per rotazioni dell'anello imidazolico intorno all'asse passante per il suo centroide, tenendo gli anelli in piani paralleli. Gli arrangiamenti perpendicolari risultano sempre meno stabili di quelli paralleli. Inoltre il complesso con gli assi dei centroidi spostati di 1 Å è più stabile di quello con i centroidi allineati lungo lo stesso asse, come confermato da calcoli MP2/DZP non corretti CP.

 Lavoro 4. Lo studio delle interazioni deboli di stacking, che giocano un ruolo importante nei meccanismi biologici e nella regolazione delle funzioni biologiche, è stato esteso per tre arrangiamenti (1esaB, 1s01, 1lla -utilizzando il nome del file PDB a cui appartengono-, mostrati nella figura con gli anelli indolici sovrapposti) ai complessi tra indolo e 5-metilimidazolo epsilon, o protonato, per confrontarne la stabilità con gli addotti già studiati [2] contenenti delta,5-metilimidazolo, usando la base 6-31G*con gli esponenti d ridotti a 0.25, denominata 6-31G*(0.25), e le geometrie interne HF/6-31G* ottimizzate nei partners isolati. L'andamento dell'energia di interazione è stato studiato lungo tutto il cammino di avvicinamento e non ad un solo valore della distanza. 
La posizione dell'H su 5-metilimidazolo (sia delta o epsilon) non influenza molto i risultati quando gli anelli aromatici sono quasi paralleli o in un arrangiamento T-shaped con imidazolo across: la differenza di energia tra i due addotti (che favorisce 1s01epsilon ed 1llaepsilon) è di circa 1.5 e 0.9 kcal/mol, rispettivamente. Al contrario si ha una notevole stabilizzazione dell'addotto quando l'H dell'imidazolo punta verso la densità pi greco dell'anello dell'indolo (1esaBe è repulsivo a livello HF, mentre 1esaBd è favorito di 3.7 kcal/mol a livello HF e di 5.5 kcal/mol a livello MP2).
Gli addotti con l'imidazolo in forma protonata sono molto più stabili di quelli con il 5-metilimidazolo neutro per l'effetto elettrostatico del catione, che aumenta notevolmente le energie di interazione e accorcia le distanze intermolecolari. In tutti i casi l'inclusione delle correzioni counterpoise a livello HF ed MP2 non modifica sostanzialmente l'andamento dell'interazione, rendendo le energie di interazione meno favorevoli a distanze di equilibrio più grandi.
È stato preso in esame anche l'effetto prodotto sull'energia e sulla distanza di equilibrio dei complessi dalla presenza di un set di funzioni di polarizzazione sugli idrogeni con esponenti sia normali che ridotti (descrizioni 6-31G** e 6-31G**(0.25,0.15)). Sono stati condotti studi preliminari sulla stabilizzazione preferenziale di questi complessi prodotta dalle cariche parziali degli altri residui (con almeno un atomo entro 6 Å dalla coppia descritta ab initio) contenuti in queste proteine.

 1. G. Alagona, C. Ghio, S. Monti, The Effect of Small Substituents in 5 or 6 position on the Properties of Indole. An ab initio 6-31G* Study, J. Mol. Struct. (Theochem) 433, 203-216 (1998)

 2. G. Alagona, C. Ghio, S. Monti, Ab Initio Investigation of the Methylimidazole-Indole Complexes, as Models of the Histidine-Tryptophan Pair, J. Phys. Chem. A 102, 6152-6160 (1998)

 3. G. Alagona, C. Ghio, A. Giolitti, S. Monti, Theoretical Investigation of the Histidine-Tryptophan Preferential Interactions, Theor. Chem. Acc. 101, 143-150 (1999)

4. G. Alagona, C. Ghio, S. Monti, Ab Initio Study of Preferential Interactions Between Aromatic Side Chains, Int. J. Quantum Chem. BQ 73, 175-186 (1999)

 Poster 4. Le antracicline esercitano azioni multiple a livello cellulare e la loro attività citotossica è stata largamente attribuita al loro legarsi al DNA per intercalazione. Sembra, però, che ci siano anche altri fattori che governano la potenza citotossica e l'attività anti-tumorale di questi antibiotici. Dati sperimentali hanno dimostrato che modifiche minori alla struttura chimica influenzano fortemente l'attività anticancerogena.
Il composto MEN10755, 4-dimetossi-7-O-[2,6-dideossi-4-O-(2,3,6-trideossi-3-ammino-alpha-L-liso- esopiranos-il)- alpha-L-liso-esopiranosil]adriamicinone, che costituisce il primo esempio di disaccaride analogo della doxorubicina ed appartiene ad una nuova serie di ammino disaccaridi sintetici delle antracicline, ha mostrato attività superiore alla doxorubicina sugli animali di sperimentazione in alcuni tipi di cancro umano.
Il complesso tra MEN10755 ed il B-DNA, d(TCGATCGA)2, è stato studiato mediante simulazioni di meccanica molecolare utilizzando il force field AMBER-1994. Le cariche parziali sugli atomi del farmaco sono state determinate con il metodo RESP dopo aver calcolato ab initio con base 6-31G* il potenziale elettrostatico molecolare nello spazio circostante la struttura. La conformazione di MEN10755 utilizzata per il calcolo delle cariche è stata ottenuta ottimizzando ab initio a livello SCF con base 3-21G una delle strutture di minima energia ottenute attraverso analisi conformazionale eseguita con il programma SYBYL e concorde con i dati sperimentali di risonanza magnetica nucleare [1].
L'ottamero TCGATCGA, scelto come sequenza canonica per lo studio strutturale, è stato ottenuto aggiungendo alla struttura cristallina del complesso 1:2 di CGATCG con la doxorubicina [2] una coppia di basi ad entrambe le estremità con lo scopo di ridurre gli effetti di bordo. MEN10755 è stato intercalato sovrapponendo l'aglicone a quello della doxorubicina, presa come struttura di riferimento, ed il complesso 2:1 MEN10755-DNA così ottenuto è stato minimizzato scegliendo una costante dielettrica e= r ed aggiungendo 12 controioni positivi esaidrati per assicurare la neutralità elettrica.
Per investigare le caratteristiche di binding e l'interazione del farmaco, soprattutto della sua parte glicosidica, con il sito legante, sono state eseguite più simulazioni modificando i torsionali che definiscono la posizione nel minor groove dei due glicosidi della molecola.
La conformazione dell'anello A e l'orientazione dell'aglicone, stabilizzata dal formarsi di due legami ad idrogeno diretti tra l'O9 dell'antraciclina e l'N2 e l'N3 del residuo di guanina adiacente, si conserva nella serie dei complessi esaminati.
Per valutare tra i modelli generati la conformazione preferenziale assunta dalla molecola MEN10755 nel legarsi al frammento di DNA scelto, è stato considerato il bilanciamento totale di energia, delta E. L'affidabilità di questo parametro è stata testata analizzando la specificità di sequenza nell'intercalazione della daunomicina in 5 ottameri di B-DNA doppia elica e confrontando i risultati con quelli ottenuti con i calcoli teorici disponibili [3].

 [1] E. Monteagudo, A. Madami, F. Animati, P.Lombardi, F. Arcamone, Carbohydrate Research, 300 (1997) 11-16.

 [2] C.A. Frederick, L.D. Williams, G. Ughetto, G.A. van der Marel, J.H. van Boom, A. Rich, A.H.J. Wang, Biochemistry, 29 (1990) 2538-2549.

 [3] B. Pullman "Molecular Mechanisms of Specificity in DNA Antitumor Drug Interactions" in Theoretical Biochemistry and Molecular Biophysics, David L. Beveridge and Richard Lavery, Eds.

 

ARTICOLI STAMPATI O IN CORSO DI STAMPA

RIASSUNTI PUBBLICATI IN ATTI DI CONGRESSI

 1 - G. Alagona, C. Ghio, A. Giolitti, S. Monti
Theoretical Investigation on Histidine-Tryptophan Preferential Interactions.
European Conference "Computational Chemistry and the Living World: from Sequence to Function"
Chambéry (French Alps), p. 1 20-24 Aprile (1998)

 2 - G. Alagona, C. Ghio, S. Monti
Ab Initio Study of Preferential Interactions Between Aromatic Side Chains.
ISQBP Meeting "Molecular Structure and Dynamics in Biology"
La Biodola, Elba (Italy), p. 1-2 8-11 Sett. (1998)

 3 - G. Alagona, C. Ghio, R. Giorgi, S. Monti
Molecular Mechanics Studies of MEN10755, and the Complex MEN10755-d(TCGATCGA)2. ISQBP Meeting "Molecular Structure and Dynamics in Biology"
La Biodola, Elba (Italy), p. 53 8-11 Sett. (1998)

 4 - G. Alagona, C. Ghio, R. Giorgi, S. Monti
Studi di meccanica molecolare del composto MEN10755, disaccaride analogo della doxorubicina.
Quitel98, XXIV Congreso Internacional de Quimicos Teoricos de Expresion Latina
Puebla, Mexico, p. 206 20-25 Sett. (1998)

 

PRESENTAZIONI A CONGRESSI

 1 - G. Alagona, C. Ghio, S. Monti Effetto della posizione del protone e della carica netta sulle interazioni indolo-istidina.
Quitel98, XXIV Congreso Internacional de Quimicos Teoricos de Expresion Latina
Puebla, Mexico, Sept. 20-25 1998


 I dati bibliografici sono stati aggiornati.