I.C.Q.E.M. 

 

PROGETTO STRATEGICO DEL C.N.R.

 MODELLISTICA COMPUTAZIONALE DI SISTEMI MOLECOLARI COMPLESSI

RELAZIONE SULL'ATTIVITÀ SVOLTA NEL 1999 NELL'AMBITO DEL PROGETTO:

Meccanismi molecolari del riconoscimento
in sistemi chimici e biochimici complessi

U.O. PRESSO L'ISTITUTO DI CHIMICA QUANTISTICA ED ENERGETICA MOLECOLARE DEL C.N.R. - PISA
(Responsabile Scientifico: C. Ghio)

Sommario: Sono stati presi in considerazione gli effetti dell'ambiente circostante (nel caso specifico può trattarsi di quello proteico o del solvente) su alcune interazioni di tipo pi greco in sistemi modello rappresentativi delle catene laterali aromatiche di amminoacidi o in un sistema complesso binario agente antitumorale/DNA. Per quello che riguarda il primo argomento, l'interazione in vacuo tra gli anelli aromatici di indolo e 5-metilimidazolo, quali modelli di triptofano ed istidina, è stata confrontata con quella ottenuta in presenza sia del campo specifico prodotto dalle cariche parziali della proteina, da cui alcune specifiche orientazioni sono state estratte, sia del campo generico del solvente (PCM).
L'intercalazione tra un antitumorale della classe delle antracicline (MEN10755) con una specifica sequenza del DNA è stata esaminata con metodi di dinamica molecolare in soluzione, in presenza di circa 5000 molecole d'acqua, utilizzando il force field AMBER94, dopo aver ricavato il modello a cariche puntiformi dell'antitumorale dal fitting con il suo potenziale elettrostatico ab initio.
Le proprietà conformazionali di alcuni isomeri della bilirubina sono state studiate in vacuo ed in soluzione, partendo da conformazioni ottenute mediante una analisi conformazionale sistematica, a causa del notevole numero di gradi di libertà torsionali del sistema.

Introduzione: Lo studio del riconoscimento molecolare da un punto di vista teorico rappresenta una sfida reale e richiede lo sviluppo di strategie e metodologie di approccio apposite. Il riconoscimento è qui inteso come interazione a livello molecolare tra un sistema di dimensioni abbastanza limitate ed uno molto più esteso, rappresentati ad esempio dalle coppie ligando (o farmaco) e recettore, substrato (o inibitore) ed enzima, molecola e superficie, soluto e solvente, ecc. Non si tratta perciò solo di problemi relativi alle dimensioni dei sistemi trattati. Nel caso particolare di interazioni tra farmaco e DNA, il tipo di interazione può cambiare radicalmente a seconda della sequenza di DNA considerata e della sua lunghezza. Inoltre proprietà e caratteristiche delle interazioni tra i composti possono variare notevolmente in dipendenza dell'ambiente in cui i partners interagenti si trovano.
In questo terzo anno di attività abbiamo pertanto rivolto l'attenzione particolarmente all'effetto dell'ambiente circostante, sia che si tratti di una proteina o del solvente, su varie interazioni.

RELAZIONE

Abbiamo già descritto nella relazione precedente, relativa all'attività svolta nel 1998, i lavori 1 e 2 (allora rispettivamente in corso di stampa e inviato), di cui è ora disponibile la referenza bibliografica.
Nel corso del terzo anno di attività è stato completato lo studio delle interazioni tra un segmento di DNA ed un antitumorale della classe delle antracicline, il MEN10755, disaccaride analogo della doxorubicina. Sono stati esaminati anche altri intercalanti della stessa classe, che si sono dimostrati più o meno attivi come agenti antitumorali, allo scopo di correlarne le proprietà con le loro caratteristiche di legame. I risultati ottenuti sono stati pubblicati, insieme con una descrizione dettagliata della metodologia seguita, sui Folia Chimica Theoretica Latina.

Lavoro 3/Riass. 2: È stata dapprima effettuata la validazione dei modelli (2:1) di daunorubicina/DNA estratti dal Brookhaven PDB [1], mediante l'utilizzo di diversi segmenti di DNA (+controioni idrati), tutti più lunghi di quelli disponibili in letteratura, per evitare artificiose distorsioni delle basi adiacenti all'intercalante, sempre collocato all'estremità del segmento nelle strutture risolte. I risultati ottenuti sono in buon accordo con quelli di Pullman [2]. Questo ci ha permesso di calibrare il metodo di indagine, studiando la specificità di sequenza delle basi nellŐ'ntercalazione del farmaco, e di scegliere per lo studio del complesso con il MEN10755 la sequenza più adatta.
La struttura di MEN10755, che è costituito da una parte rigida ad anelli condensati (aglicone) e da una catena laterale formata da due zuccheri, è disponibile soltanto in soluzione da dati NMR [3]. È stata perciò effettuata un'analisi conformazionale sistematica per determinare i valori più probabili degli angoli torsionali che definiscono l'orientazione dei due zuccheri. Le cariche parziali atomiche del farmaco, calcolate col metodo di Merz-Kollman [4] come fitting del potenziale elettrostatico a livello HF/6-31G*//3-21G, sono state riaggiustate utilizzando il metodo RESP [5], in modo da forzare l'equivalenza degli idrogeni metilici ed etilici.
È stato così valutato l'effetto della conformazione assiale o equatoriale del legame a ponte tra i due zuccheri, sostituenti dell'aglicone in posizione opportuna, che concorrono alla stabilità dell'addotto interagendo con il minor groove del DNA, nel quale si adagiano, allo scopo di correlarne la struttura con le proprietà di legame nel minor groove. Per fare questo sono state effettuate simulazioni su più copie del sistema, che si differenziavano per i valori assunti dai torsionali che definiscono la posizione dei due zuccheri nel minor groove. La posizione del primo zucchero risulta essere analoga a quella assunta dalla parte glicosidica della daunorubicina. Esso è infatti inserito senza impedimenti sterici nel solco minore e forma un legame a idrogeno tra il suo ossidrile in posizione 3 e le basi di adenina e timina situate nella parte centrale della sequenza. L'amminozucchero gode di maggiore flessibilità e libertè di rotazione, essendo più lontano dall'aglicone. La sua interazione con il DNA è favorevole ed è stabilizzata dalla formazione di legami a idrogeno tra i suoi gruppi NH3+ e/o OH- in posizione 4 e le vicine basi di guanina e citosina.
La trascrizione e la replicazione del DNA richiede lo svolgimento della doppia elica, cosa che comporta un notevole cambiamento strutturale. Perciò è di grande interesse studiare come il binding di MEN10755 altera la mobilità e le proprietà strutturali del DNA doppia elica autocomplementare, anche se non se ne conosce il meccanismo d'azione, che potrebbe coinvolgere complessi ternari DNA-farmaco-topoisomerasi. La topologia del DNA durante i processi di trascrizione, replicazione e ricombinazione è infatti regolata dalle DNA-topoisomerasi, che sono enzimi nucleari essenziali per lŐintegrià del materiale genetico. È questo il motivo per cui questi enzimi degli eucarioti sono i bersagli cellulari di molti farmaci antitumorali, quali gli intercalanti, che interferiscono con il meccanismo delle topoisomerasi formando i complessi ternari sopra ricordati. Le topoisomerasi si legano ugualmente al DNA intercalato, ma non riescono a riconnetterlo e a staccarlo, in quanto il farmaco agisce come un uncino che tiene l'enzima attaccato al DNA. Altri fattori cellulari rilevano poi questo danno e mandano la cellula in morte apoptotica.
Sono state inoltre effettuate simulazioni di dinamica molecolare del sistema su scala temporale dell'ordine del nanosecondo, partendo da una conformazione di minima energia, con l'inclusione di molecole d'acqua esplicite nell'insieme canonico NPT, per valutare gli effetti strutturali che il farmaco potrebbe avere sul DNA in presenza del solvente. Queste simulazioni sono diventate fattibili grazie allo sviluppo di metodi rapidi ed accurati per trattare le interazioni elettrostatiche a lungo raggio, quali il Particle Mesh Ewald (PME) implementato in AMBER 4.1 [6], che usa per dividere l'energia totale elettrostatica la somma di Ewald diretta e reciproca, invece dell'approccio della "switching function", ed è più preciso del metodo PME originale.
Lo stesso procedimento è stato ripetuto su di un segmento più corto di DNA, per esaminare quanto la presenza di un altro intercalante sia responsabile della posizione più esterna del secondo zucchero. I risultati strutturali sostanzialmente non cambiano. Sembra tuttavia che per la funzionalità delle antracicline sia fondamentale la presenza di due intercalanti a breve distanza tra loro, come indicato dalle strutture cristallografiche.

[1] J.B. Chaires, J.E. Herrera, M.J. Waring, Biochemistry 25, 9 (1986).
[2] B. Pullman, in Theoretical Biochemistry & Molecular Biophysics, D.L. Beveridge & R. Lavery (Eds.), Adenine Press (1991), vol. 2, p. 193.
[3] E. Monteagudo, A. Madami, F. Animati, P. Lombardi, F. Arcamone, Carbohydrate Research 300, 11 (1997).
[4] B.H. Besler, K.M. Merz Jr., P.A. Kollman, J. Comp. Chem. 11, 431 (1990).
[5] D.A. Pearlman, D.A. case, J.W. Caldwell, W.S. Ross, T.E. Cheatham III, D.M. Ferguson, G.L. Seibel, U. Chandra Singh, P.K. Weiner, P.A. Kollman (1995) AMBER 4.1, University of California, San Francisco.
[6] P. Cieplak, W. Cornell, C. Bayly, P.A. Kollman, J. Comp. Chem. 16, 1357 (1995).

Il programma svolto nel terzo anno di attività è consistito, inoltre, nell'analisi dell'effetto del solvente su complessi di tipo pi greco e su alcuni isomeri della bilirubina (che in senso lato può essere considerata un complesso di tipo pi greco).

Lavoro 4/Riass.1,3-5/a-b: Come preannunciato nella relazione del 1998, è stata presa in considerazione anche la stabilizzazione preferenziale dei complessi pi greco sotto studio (His-Trp, modellati attraverso 5-metilimidazolo e indolo) prodotta dalle cariche parziali degli altri residui contenuti nelle proteine da cui le coppie in esame sono state estratte.
È stata esaminata quindi l'influenza dei residui amminoacidici intorno all'addotto His-Trp considerando differenti descrizioni dell'intero sistema. Dato che non è nota a priori la protonazione dell'istidina di interesse, sono stati considerati tre modelli distinti delle proteine in esame. Nel modello 1 l'istidina è stata considerata neutra con il protone sull'azoto epsilon; nel modello 2, neutra, con il protone sull'azoto delta; infine, nel modello 3, carica +1, con il protone sia sull'azoto epsilon che sull'azoto delta. Gli atomi di idrogeno, mancanti nel file PDB, sono stati aggiunti a tutti gli altri residui della proteina in modo coerente con la forza ionica per tutti e tre i modelli, ottimizzandone le posizioni con AMBER 4.1 mentre tutti gli atomi pesanti venivano mantenuti fissi. Partendo dalle strutture così ottenute, sono stati effettuati successivamente due diversi tipi di ottimizzazione: a) una ottimizzazione libera dell'intero sistema e b) una ottimizzazione vincolata in cui i due residui Trp e His sono stati mantenuti fissi, in modo da permettere ai residui circostanti di riaggiustarsi intorno alla geometria sperimentale dell'addotto. La struttura ottenuta con il secondo metodo è stata poi ottimizzata rilasciando tutte le costrizioni. I residui Trp e His sono stati quindi sostituiti con i loro modelli, indolo e 5-metilimidazolo (epsilon, delta, +), ottimizzati a livello HF/6-31G*. L'effetto delle cariche parziali dei residui della proteina sulla distribuzione di carica e sull'energia degli addotti è stato calcolato ab initio, inserendo le cariche di tutti i residui che hanno almeno un atomo entro 6 Angs da ciascun addotto (comprese le molecole d'acqua di cristallizzazione ed i controioni puntiformi necessari per neutralizzare il sistema), come perturbatori nell'Hamiltoniano monoelettronico.
La stabilità degli addotti epsilon e delta è risultata molto maggiore nella proteina rispetto al vuoto nei modelli ottimizzati liberamente, mentre l'effetto dell'ambiente è stato molto meno evidente nei modelli che avevano dovuto rispettare il vincolo iniziale di mantenere l'orientazione cristallografica. L'addotto protonato (+) è stato in tutti i casi fortemente influenzato dall'intorno proteico. Infatti in questo caso sono due gli idrogeni polari del 5-metilimidazolo che possono formare legami ad idrogeno con i residui vicini.
È stata esaminata successivamente l'influenza del solvente descritto come un dielettrico continuo intorno al soluto quantomeccanico per valutare l'effetto di campi generici di diversa costante dielettrica (acqua e cloroformio) e confrontarlo con il campo specifico della proteina. I valori delle energie ottenuti in cloroformio, compromesso ragionevole tra un ambiente lipidico e l'interno di una proteina, sono risultati molto vicini ai valori calcolati in vacuo, come ci si aspetta per la bassa costante dielettrica di tale solvente, molto vicina a quella del vuoto.

Notare che i lavori 3 e 4 sono apparsi nel 1999, anche se riportano la data del 1998 per un ritardo editoriale subito negli anni passati da entrambe le riviste.

Lavoro 5. È stata presa in esame la stabilità in vacuo ed in soluzione di vari isomeri della bilirubina, oltre al diastereoisomero naturale ZZ da noi già studiato [Int. J. Quantum Chem. 70, 395-405 (1998)], ottenibili solo per rotazione intorno al legame, doppio nella forma naturale, tra il C a ponte tra gli anelli aromatici ed il C dell'anello più esterno in ciascuno dei cromofori dipirrinonici, che costituiscono le lame del "molecular propeller". L'ipotesi avanzata è infatti che l'effetto della luce UV-Vis, usata per curare i neonati affetti da ittero, consista proprio nella rottura di quel doppio legame, permettendo così una transizione conformazionale, altrimenti impossibile, ad una forma più solubile, escreta con i liquidi biologici. Purtroppo ottimizzazioni di geometria in vacuo ed in soluzione, effettuate preliminarmente con AMSOL, hanno mostrato l'inadeguatezza di questo hamiltoniano modello (AM1) e del metodo di studio della solvatazione ivi impiegato, per lo studio di un sistema con una struttura etero-aromatica così complessa. Pertanto abbiamo dovuto utilizzare il metodo ab initio HF/6-31G*//3-21Gvac del continuo polarizzabile (PCM) con alcuni punti effettuati per verifica a livello HF/6-31G*//6-31G*vac. Le ottimizzazioni di geometria in soluzione per questo sistema infatti sono ben oltre le nostre attuali potenzialità di calcolo, pur avendo modellato la bilirubina senza i quattro gruppi metilici che si trovano complessivamente sugli anelli eteroaromatici.
È stata inoltre valutata la barriera di interconversione in fase gassosa ed in soluzione tra i due enantiomeri (M e P), dalla caratteristica forma "ridge-tile", che costituiscono il minimo globale della bilirubina. Si è poi tentato di determinare quali strutture corrispondano al cammino di minima energia da un enantiomero all'altro. Per entrambi questi scopi è stato necessario effettuare l'analisi conformazionale del sistema, in quanto la presenza di più di dieci gradi di libertà torsionali impedisce che il minimo globale (o almeno uno dei minimi più profondi) venga raggiunto con gli usuali algoritmi di ottimizzazione, che si arrestano nel minimo più vicino alla struttura di partenza. Per ottenere strutture di partenza adeguate, si è fatto perciò ricorso ad una ricerca conformazionale sistematica utilizzando la meccanica molecolare (MM), seguita da minimizzazione di MM delle strutture con energia sotto una certa soglia. Le strutture più promettenti sono state poi ottimizzate ab initio a livello HF/3-21G, ed infine sono stati effettuati calcoli singolo punto a livello HF/6-31G*.
Per stabilire sotto quale forma la bilirubina venga eliminata, stabilità e proprietà in soluzione della bilirubina normale (ZZ) sono state paragonate a quelle degli isomeri ottenibili per fotoirradiazione. Alcuni prodotti della fotoisomerizzazione Z to E sono stati "model built" partendo dai conformeri ZZ ed ottimizzati a livello HF/3-21G. In aggiunta ottimizzazioni HF/6-31G* sono state effettuate su conformeri scelti, su cui è stato calcolato l'effetto del solvente con il PCM allo stesso livello. Le correzioni correlative a livello MP2, in fase gassosa, stabilizzano la struttura di minima energia rispetto al punto di sella per l'interconversione M-P. Tutti i risultati ottenuti per le conformazioni degli isomeri qui considerate, in buon accordo con quelle HF/6-31G*//HF/3-21G, in conclusione, non mostrano una solvatazione preferenziale per le forme E allo stato fondamentale.
Calcoli preliminari su di un piccolo sistema modello potrebbero suggerire che la bilirubina si solvati allo stato eccitato.


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SUI FOLIA CHIMICA THEORETICA LATINA

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